西安网站建设排名,如何自己做网址,网站如何批量上传产品,管理者的七项基本能力引言 在本教程中#xff0c;我们将探讨由10x Genomics公司提供的成年小鼠大脑细胞的单细胞ATAC-seq数据集。本教程中使用的所有相关文件均可在10x Genomics官方网站上获取。 本教程复现了之前在人类外周血单核细胞#xff08;PBMC#xff09;的Signac入门教程中执行的命令。… 引言 在本教程中我们将探讨由10x Genomics公司提供的成年小鼠大脑细胞的单细胞ATAC-seq数据集。本教程中使用的所有相关文件均可在10x Genomics官方网站上获取。 本教程复现了之前在人类外周血单核细胞PBMC的Signac入门教程中执行的命令。我们通过在不同的系统上进行相同的分析来展示其性能以及对不同组织类型的适用性并提供了一个来自不同物种的示例。 实战 首先我们需要导入Signac、Seurat等一些用于分析小鼠数据的软件包。 library(Signac)library(Seurat)library(EnsDb.Mmusculus.v79)library(ggplot2)library(patchwork) 预处理工作流程 counts - Read10X_h5(../vignette_data/atac_v1_adult_brain_fresh_5k_filtered_peak_bc_matrix.h5)metadata - read.csv( file ../vignette_data/atac_v1_adult_brain_fresh_5k_singlecell.csv, header TRUE, row.names 1)brain_assay - CreateChromatinAssay( counts counts, sep c(:, -), genome mm10, fragments ../vignette_data/atac_v1_adult_brain_fresh_5k_fragments.tsv.gz, min.cells 1)brain - CreateSeuratObject( counts brain_assay, assay peaks, project ATAC, meta.data metadata) 我们还可以向小鼠基因组的大脑对象添加基因注释。这将允许下游函数直接从对象中提取基因注释信息。 # extract gene annotations from EnsDbannotations - GetGRangesFromEnsDb(ensdb EnsDb.Mmusculus.v79)# change to UCSC style since the data was mapped to hg19seqlevels(annotations) - paste0(chr, seqlevels(annotations))genome(annotations) - mm10# add the gene information to the objectAnnotation(brain) - annotations 计算 QC 指标 接下来我们计算一些有用的细胞 QC 指标。 brain - NucleosomeSignal(object brain) 我们可以分析所有细胞的DNA片段长度的周期性变化并根据细胞核小体信号的强弱进行分类。观察结果表明那些在单核小体与无核小体比例上表现异常的细胞呈现出与其他细胞不同的条带图谱。而其他细胞则显示出了一次成功的ATAC-seq实验所特有的典型模式。 brain$nucleosome_group - ifelse(brain$nucleosome_signal 4, NS 4, NS 4)FragmentHistogram(object brain, group.by nucleosome_group, region chr1-1-10000000) 在ATAC-seq实验中Tn5转座酶在转录起始位点TSS处的整合事件的富集程度是一个关键的质量控制指标用于评价Tn5的定位效率。ENCODE联盟将TSS富集分数定义为TSS周围Tn5整合位点的计数与这些位点在相邻区域计数的比率。在Signac软件包中我们可以使用TSSEnrichment()函数来为每个细胞计算这一富集分数。 brain - TSSEnrichment(brain, fast FALSE)brain$high.tss - ifelse(brain$TSS.enrichment 2, High, Low)TSSPlot(brain, group.by high.tss) NoLegend() brain$pct_reads_in_peaks - brain$peak_region_fragments / brain$passed_filters * 100brain$blacklist_ratio - brain$blacklist_region_fragments / brain$peak_region_fragmentsVlnPlot( object brain, features c(pct_reads_in_peaks, peak_region_fragments, TSS.enrichment, blacklist_ratio, nucleosome_signal), pt.size 0.1, ncol 5) 我们删除了这些 QC 指标异常值的细胞。 brain - subset( x brain, subset peak_region_fragments 3000 peak_region_fragments 100000 pct_reads_in_peaks 40 blacklist_ratio 0.025 nucleosome_signal 4 TSS.enrichment 2)brain## An object of class Seurat ## 157203 features across 3512 samples within 1 assay ## Active assay: peaks (157203 features, 0 variable features)## 2 layers present: counts, data 归一化和线性降维 brain - RunTFIDF(brain)brain - FindTopFeatures(brain, min.cutoff q0)brain - RunSVD(object brain) 在分析中LSI线性判别分析的第一个主成分往往反映的是测序的深度即技术层面的变异而非生物学上的变异。如果确实如此那么在后续的分析中应该将这一成分排除掉。为了判断是否存在这种情况我们可以通过调用DepthCor()函数来计算每个LSI主成分与测序深度之间的相关性。 DepthCor(brain) 在这里我们看到第一个 LSI 组件与细胞的计数总数之间存在非常强的相关性因此我们将在没有该组件的情况下执行下游步骤。 非线性降维和聚类 细胞数据已经被嵌入到一个低维度的空间里我们可以采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据常用的分析方法执行基于图谱的聚类分析并通过非线性降维技术来进行数据可视化。RunUMAP()、FindNeighbors()和FindClusters()这些功能均集成在Seurat软件包中。 brain - RunUMAP( object brain, reduction lsi, dims 2:30)brain - FindNeighbors( object brain, reduction lsi, dims 2:30)brain - FindClusters( object brain, algorithm 3, resolution 1.2, verbose FALSE)DimPlot(object brain, label TRUE) NoLegend() 本文由 mdnice 多平台发布
