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梨#xff08;Pyrus ssp.#xff0c;蔷薇科杏仁核亚科#xff09;是世界上最重要的温带水果作物之一。与野生梨相比#xff0c;栽培梨的果实在许多形态特征上表现出显著变化#xf…大家好这里是专注表观组学十余年领跑多组学科研服务的易基因。
梨Pyrus ssp.蔷薇科杏仁核亚科是世界上最重要的温带水果作物之一。与野生梨相比栽培梨的果实在许多形态特征上表现出显著变化包括果实大小、含糖量和核细胞含量。野生梨和栽培梨之间的比较分析可以深入了解关键表型变化的演变。DNA甲基化是一种重要的可遗传表观遗传学标记可以改变基因组区域可及性抑制或激活基因表达最终导致表型变化。然而表观等位基因在多年生果树驯化中的重要性尚待发现。
在植物中胞嘧啶DNA甲基化发生在三种不同的背景中CG、CHG和CHHHA、T或G。DNA甲基化水平受到四种去甲基化酶的调节包括抑制沉默1/Demeter样1ROS1/DML1、DemeterDME、Demeter样2DML2和Demeter样3DML3。
2024年4月5日南京农业大学吴俊教授团队对41份亚洲梨Pyruspyrifolia样本包括野生品种、地方品种和改良品种进行了单碱基分辨率的甲基化分析。通过比较甲基化分析在梨的驯化和改良过程中全基因组DNA甲基化水平增加与编码DNA去甲基化酶的基因表达水平降低相关。研究还鉴定出梨的驯化和改良过程中的差异化甲基化区域DMRs。高甲基化DMRs基因与植物衰老和果实成熟显著相关。研究为揭示多年生果树驯化和改良过程中表观遗传调控重要性状的作用机制提供参考为指导梨重要性状遗传改良提供了理论依据。相关研究成果以Increased DNA methylation contributes to the early ripening of pear fruits during domestication and improvement为题发表在《Genome Biology》IF 12.3 / 1区期刊上。 研究摘要
本研究利用全基因组重亚硫酸盐测序技术研究了41份梨样本进行了梨驯化和改良过程中的DNA甲基化变化。与水稻驯化期间的显著减少相反研究结果表明梨驯化和改良过程中整体DNA甲基化水平增加。梨的DNA甲基化特定增加与人类选择导致的Demeter-like1DML1编码DNA去甲基化酶的下调显著相关。研究总共鉴定出5591个差异甲基化区域DMRs。在梨的驯化和改良过程中CG和CHG中的甲基化经历共同进化。DMRs比选择性扫描区域具有更高的遗传多样性特别是在内含子中。大约97%的DMRs与任何SNPs无关这些DMRs与淀粉和蔗糖代谢以及苯丙烷生物合成相关。此外研究还进行DNA甲基化与基因表达的相关性分析。分析结果表明高甲基化DMRs基因与果实成熟显著相关进一步验证与高甲基化DMRs相关基因CAMTA2的功能并验证在番茄和梨愈伤组织中CAMTA2过表达抑制了果实成熟。
总之本研究揭示了多年生梨树驯化和改良过程中DNA甲基化的特定模式并表明DNA甲基化增加在梨果早熟中发挥着重要作用。 研究方法 结果图形
1人对Demeter样1DML1选择可能与梨驯化和改良过程中DNA甲基化增加有关
为分析梨驯化和改良过程中发生的全基因组DNA甲基化变化研究人员构建了全基因组重亚硫酸盐测序WGBS文库包含41个代表性P. pyrifolia品种的两个生物学重复其中包括14个野生品种、12个地方品种和15个改良梨品种。平均BS转化率为99.44%。以P. pyrifolia “Cuiguan”基因组为参考基因组。 图1梨基因组中DNA胞嘧啶甲基化水平的分布模式
17条梨染色体上的CG、CHG和CHH下DNA甲基化水平的密度分布、基因密度和TE密度。三个梨品种野生品种、地方品种和改良品种中CG、CHG和CHH甲基化胞嘧啶mC平均比率。野生品种、地方品种和改良品种中CG、CHG和CHH甲基化水平进行比较*P 0.05; **P 0.01; ***P 0.001双尾配对学生t检验。基因和转座元件TEs的上下游±2kb区域、和genebody区域的DNA甲基化水平分布。在野生品种、地方品种和改良品种中PpyDML1.1、PpyDML1.2和PpyDML1.3的相对基因表达水平比较FPKM。PpyDML1.1、PpyDML1.2和PpyDML1.3在梨驯化和改良过程中表达水平持续下降*P 0.05; **P 0.01; ***P 0.001使用cuffdiff进行差异表达分析。
2梨驯化和改良过程中CG和CHG甲基化的共同进化 图2野生品种梨 vs地方品种梨以及地方品种梨vs改良品种梨的差异甲基化区域DMRs比较
CG中的DNA甲基化水平主成分分析PCA图。黄色方块野生梨品种蓝色点地方品种绿色三角形改良品种。CHG中的DNA甲基化水平主成分分析PCA图。比较野生与地方品种、地方品种与改良品种以及野生与改良品种的高甲基化/低甲基化DMRshyper/hypo-DMRs数量。c中三种比较中高甲基化/低甲基化DMRs的总长度。比较野生与地方品种和地方品种与改良品种比较中DNA序列选择区域DSRs长度与CG和CHG背景DMRs的长度*P 0.05; **P 0.01; ***P 0.001双尾配对学生t检验。显示DSRs和DMRs的基因组组成包括转座元件TEs、内含子、外显子和基因间区域。对17条梨染色体上野生与地方品种群间DMRs分布图。从外圈到内圈的数据分别代表TE密度I、基因密度II、驯化过程中CG-DMR密度III、驯化过程中CHG-DMR密度IV、改良过程中CG-DMR密度V、改良过程中CHG-DMR密度VI、驯化过程中的DSRVII和改良过程中的DSRVIII。对野生与地方品种CG和CHG背景以及地方种与改良品种之间的DMRs重叠分析。对野生与地方品种驯化过程和地方品种与改良品种改良过程比较中两种甲基化背景的DMRs重叠。在梨驯化过程中o_CG_CHG_DMRsCG-DMRs与CHG-DMRs重叠区域的CG和CHG甲基化水平相关性分析。在梨改良过程中对o_CG_CHG_DMRs的CG和CHG甲基化水平进行相关性分析。
3遗传多样性变化与梨驯化和改良过程中的DNA甲基化变化无关 图3梨的驯化过程中差异甲基化区域DMRs的遗传多样性变化
a-d. 所有梨a和野生品种梨b、地方品种梨c和改良品种梨d不同基因组组成中DMR、DSRs和NSRs之间的遗传多样性比较*P0.05**P0.01***P0.001NS不显著双尾配对学生t检验。不同基因组组成包括基因间区域、TE、外显子和内含子。
e-f. 在驯化Dom-DMRse和改良Imp-DMRsf过程中高甲基化DMRs和低甲基化DMRs的遗传多样性变化。每一条黑线代表一个DMR。
g. dom CG DMR、dom CHG DMR、imp CG DMR和imp CHG DMRs中DNA甲基化水平与遗传多样性之间的关系。
4DMRs遗传基础的meQTL分析 图4梨驯化和改良过程中差异甲基化区域DMRs的遗传基础。
在梨驯化和改良过程中鉴定的meQTL的染色体位置分布。x轴表示显著SNPs的基因组位置y轴表示SNPs相应DMR的基因组位置。点的颜色表示meQTL分析中的P值。meQTL显著阈值设定为1.78×10−90.01/NN5618948仅绘制显著meQTL。Dom-CG-DMR代表野生和地方品种之间的CG DMRDom-CHG-DMR代表野生和地方品种之间的CHG DMRsImp-CG-DMR代表地方品种和改良品种之间的CG-DMRImp CHG DMR代表地方品种和改良梨品种之间的CHG DMRs。每个DMR的显著SNP数量分布。每个SNP的显著相关DMR的数量分布。梨驯化和改良过程中CG和CHG DMRs的遗传基础。
5DNA甲基化对基因表达的作用 图5梨驯化改良过程中DNA甲基化与基因表达水平的相关性研究。
在2kb上游、基因体和2kb下游区域的所有基因的CG和CHG甲基化水平与表达水平之间的关系。根据表达水平将基因分为四组低、中低、中高和高。
b-c. 梨驯化b和改良c过程中2kb上游、基因体和2kb下游区域的基因表达水平与CG和CHG环境中DMR甲基化水平之间的Pearson相关系数分布。
6梨驯化和改良过程中DNA高甲基化与果实早熟有关 图6梨CAMTA2基因中的一个高甲基化DMR以及它在梨驯化和改良过程中的作用。
梨驯化过程中高CG DMR相关基因的GO富集分析前15个显著项。梨改良过程中高CG DMR相关基因的GO富集分析前15个显著项。蓝色星号表示与衰老相关的GO术语。CAMTA2基因结构如图顶部所示。外显子用黄色阴影框表示内含子用黑线表示蓝色阴影框表示5′和3′UTR。下图显示了野生、地方品种和改良梨品种中位于CAMTA2基因中的DMRChr13:26073542–26073668的CG甲基化水平。上图表示整个基因2kb上游、基因体和2kb下游区域下图扩大显示第11外显子中的DMR。野生品种黄框、地方品种绿框和改良品种蓝框梨中CAMTA2表达水平FPKM的比较*P0.05**P0.01***P0.001NS不显著双尾配对Student t检验 图7CAMTA2在转基因梨愈伤组织和转基因番茄植株中的作用。
CAMTA2基因在对照和5′-氮杂胞苷5′-Aza处理的梨愈伤组织中的相对表达。CAMTA2-GFP融合蛋白定位于农业过滤的本氏烟草Nicotiana benthamiana叶片细胞的细胞核。WT和CAMTA2过表达OE梨愈伤组织的生长。P1继代培养后立即P2继代培养后14天P3继代培养后24天。
d-e. 用甲苯胺蓝染色的梨愈伤组织的横截面。图像显示了过表达CAMTA2e的WTd和转基因梨愈伤组织的横截面的相同视野中的细胞数量。比例尺100μm。
f. T1代转基因幼苗在移植前的生长状况。比例尺1cm。
g. WT和T1代CAMTA2-OE幼苗根长的统计分析。
h. WT和CAMTA2-OE转基因番茄植株的表型。比例尺1cm。
野生型和转基因番茄植株株高的统计分析。
j. WT CAMTA2-OE转基因番茄果实在盛开后43、46、49、52、55和57天DAFB的代表性表型。
k.在红期收获的WT和CAMTA2-OE转基因番茄果实硬度统计分析。
研究结论
本研究结果表明在梨的驯化和改良过程中DNA甲基化的整体增加。这种DNA甲基化增加与 DML1表达下调显著相关。在梨的驯化和改良过程中分别鉴定出1242个和4349个DMR。高DMRs附近基因与植物衰老和果实成熟显著相关。研究还验证了高DMRs相关基因CAMTA2的功能即CAMTA2过表达抑制果实成熟。简言之本研究报告了在梨的驯化和改良过程中DNA甲基化的增加模式并表明增加的DNA甲基化在调节梨果实成熟期中起着至关重要的作用。 关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序WGBS
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序WGBS可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基C碱基的甲基化水平是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
应用方向
WGBS广泛用于各种物种要求全基因组扫描不错过关键位点
全基因组甲基化图谱课题标志物筛选课题小规模研究课题
技术优势
应用范围广适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究全基因组覆盖最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息精确绘制甲基化图谱单碱基分辨率可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。 易基因提供全面的表观基因组学DNA甲基化、DNA羟甲基化和表观转录组学m6A、m5C、m1A、m7G、染色质结构与功能组学技术方案ChIP-seq、ATAC-seq详询易基因0755-28317900. 参考文献
Song B, Yu J, Li X, Li J, Fan J, Liu H, Wei W, Zhang L, Gu K, Liu D, Zhao K, Wu J. Increased DNA methylation contributes to the early ripening of pear fruits during domestication and improvement. Genome Biol. 2024 Apr 5;25(1):87. pii: 10.1186/s13059-024-03220-y. doi: 10.1186/s13059-024-03220-y. PubMed PMID: 38581061. 相关阅读
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