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士的宁#xff08;strychnine#xff09; 又名 番木鳖碱 的生物合成 摘要
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士的宁strychnine 又名 番木鳖碱 的生物合成 摘要
士的宁番木鳖碱是一种天然产物通过分离、结构阐明和合成努力塑造了有机化学领域。目前士的宁因其强大的神经毒性作为一种杀鼠剂被用来控制啮齿动物。士的宁的多环结构激励了化学家们开发新的合成转化和策略来获取这一分子框架但植物如何合成这一复杂结构仍然未知。本文报告了士的宁及其相关分子马钱子碱和达波灵碱的生物合成途径。此外我们成功地在烟草Nicotiana benthamiana中从上游中间体重建了士的宁、马钱子碱和达波灵碱的生物合成证明了这一类复杂的、具有药理活性的化合物可以通过代谢工程方法加以利用。
正文
士的宁——一种复杂的单萜吲哚生物碱——于1818年从番木鳖Strychnos nux-vomica毒坚果种子中分离出来该植物在中国和南亚的传统医学中被使用。目前士的宁因其神经毒性被用作杀鼠剂这种毒性通过与甘氨酸受体的高亲和力结合来介导。大约130年后士的宁的结构分别于1946年和1947年由Robinson和Woodward独立阐明。Robinson指出“就分子大小而言它是已知最复杂的物质”。几个世纪以来士的宁通过其分离、结构阐明和合成在化学领域发挥了重要作用补充图1。其多环结构激发了化学家们开发新的合成转化和策略并最终导致了自1954年首次重要的全合成以来的一系列完全合成的实现。令人惊讶的是植物如何合成这一复杂结构至今仍然未知。本文报告了士的宁、马钱子碱和达波灵碱的生物合成途径。
1948年提出了士的宁的部分生物合成假说该假说通过对番木鳖中的放射性同位素标记底物的喂养实验得到证实。这些标记研究表明像所有单萜吲哚生物碱一样士的宁源自色氨酸和香叶基二磷酸。这些起始物料首先转化为两个中心中间体首先是缝籽嗪然后通过一系列未知步骤转化为Wieland–Gumlich aldehyde。Wieland–Gumlich aldehyde被认为可以通过加入乙酸酯形成哌啶酮部分从而转化为士的宁尽管乙酸酯的加入机制和环的环化过程仍然不清楚。士的宁的后续羟基化和甲基化反应将产生马钱子碱。 部分生物合成途径是基于之前的放射性同位素喂养实验预测的。OPP焦磷酸GPP香叶基焦磷酸。
为了鉴定士的宁的生物合成基因我们选择了属于番木鳖属Loganiaceae科的两个成员一个是已知的士的宁生产者——番木鳖S. nux-vomica另一个是非生产者——番木鳖种Strychnos sp.以研究这一生物合成途径。对番木鳖的代谢分析揭示了几种番木鳖生物碱的存在包括士的宁、异士的宁、β-可鲁勃林和马钱子碱这些化合物均在根部积累补充图4。这些生物碱在非生产者中没有检测到尽管在其根部和茎部检测到了与其生物合成相关的化合物——番木鳖生物碱达波灵碱补充图5。我们从这两种植物中生成了组织特异性的RNA测序数据以便发现相关基因。
从色氨酸和香叶基焦磷酸合成缝籽嗪的生物合成途径在系统发育相关的植物长春花Catharanthus roseus夹竹桃科中已经完全阐明见补充图6展示了C. roseus和S. nux-vomica的系统发育关系。长春花合成与士的宁无关的单萜吲哚生物碱。我们很容易在番木鳖转录组中鉴定到与缝籽嗪合成途径中的每个生物合成基因的同源基因这表明缝籽嗪的生物合成途径在长春花和番木鳖中是保守的。这些基因在番木鳖根部的表达优先补充图7与之前的喂养研究一致后者表明士的宁的生物合成主要发生在根部。根据三个标准选择了后续步骤的候选基因1在番木鳖根部高表达每百万映射读数的每千碱基片段数FPKM≥202与假定的上游基因共同表达3能够编码具有催化功能的蛋白质这些功能与我们假设的生物合成途径的化学逻辑一致图2。 士的宁和达波灵碱都来源于相同的生物合成中间体——Wieland–Gumlich aldehyde。 a番木鳖S. nux-vomica中已鉴定基因的表达谱。每个基因的表达表示为番木鳖转录组的FPKM。样本集1和2代表两个生物学重复。 b使用SnvGO作为诱饵的番木鳖共表达分析。圆点表示与SnvGO共表达的基因Pearson’s r ≥ 0.95共470个基因。 c番木鳖和番木鳖种Strychnos sp.共享从缝籽嗪geissoschizine 1到Wieland–Gumlich aldehydeWieland–Gumlich aldehyde 6的共同途径。 d番木鳖种中的共表达分析。使用SpGO、SpNS1、SpNS2、SpNO和SpWS作为诱饵。圆圈表示与所有诱饵共表达的基因r 0.6共3,999个基因。在b和d中的放大并注释的圆点表示在烟草中测试的基因。
从缝籽嗪geissoschizine 1转化为Wieland–Gumlich aldehydeWieland–Gumlich aldehyde 6的化学步骤尚不明确。然而考虑到Wieland–Gumlich aldehyde6与已知的早期生物碱中间体dehydropreakuammicine2dehydropreakuammicine 2之间的结构相似性化学逻辑表明Wieland–Gumlich aldehyde6可能通过酯水解、脱羧、氧化和还原反应从dehydropreakuammicine2转化而来补充图2。如果这一假设是正确的那么番木鳖应包含缝籽嗪氧化酶的同源物这种酶也已从长春花C. roseus中分离出来CrGO。在体外CrGO将缝籽嗪转化为akuammicine3可能是通过dehydropreakuammicine2的自发去甲酰化反应参考文献19图3a和补充图2。使用CrGO作为查询对番木鳖转录组进行BLAST搜索识别到一个匹配项转录簇4032.29856CYP71AY6该匹配项的氨基酸序列相似度为46%补充图8并且显示出与上游生物合成基因候选基因相似的表达谱图2a。我们通过农杆菌介导的瞬时表达将该基因在烟草叶片中表达并随后进行缝籽嗪1的浸泡处理。叶片提取物的液相色谱-质谱分析显示了dehydropreakuammicine的去甲酰化产物——akuammicine3图3b和扩展数据图1。因此转录簇4032.29856被命名为SnvGO。 a通向达波灵碱diaboline 8、士的宁strychnine 10和马钱子碱brucine 15生成的完整生物合成途径。菱形表示在番木鳖S. nux-vomica中检测到的中间体扩展数据图10。 b番木鳖中在表达指定酶和浸泡缝籽嗪1后生成的产物的液相色谱-质谱峰面积。数据为均值±标准误差n 3个生物学重复。 c番木鳖中在表达指定酶和浸泡士的宁10后生成的产物的液相色谱-质谱峰面积。数据为均值±标准误差n 3个生物学重复。实验操作表达指定酶并浸泡底物后进行的处理。 d番木鳖叶片中表达所有九种酶并浸泡缝籽嗪1和二钠丙二酸后的士的宁10、异士的宁11、β-可鲁勃林13和马钱子碱15的提取离子色谱图EIC。所有中间体均通过与合成的标准物质比较验证见补充信息中的合成程序。
由于已知甲基酯的脱羧反应可以通过酯水解触发我们推测α/β水解酶可以水解dehydropreakuammicine2的酯部分从而在自发的去甲酰化反应生成akuammicine3之前导致脱羧反应。这将导致生成番木鳖生物碱去甲氟箭毒素4图3a和补充图2。基于使用SnvGO作为诱饵的共表达分析我们初步选择了五个α/β水解酶Pearson相关系数r ≥ 0.95进行功能表征图2b。每个酶与SnvGO和缝籽嗪1作为底物一起在番木鳖中进行测试。两种候选酶转录簇4032.2064和4032.2781导致生成去甲氟箭毒素4并显著减少了去甲酰化产物akuammicine3的水平图3b和扩展数据图1。因此我们将这两种α/β水解酶命名为去甲氟箭毒素合成酶1和2SnvNS1和SnvNS2。SnvNS1和SnvNS2在蛋白质水平上有74%的序列同一性并且在番木鳖瞬时表达系统中表现出相同的反应性。我们在所有后续实验中使用了SnvNS1。
为了将去甲氟箭毒素4转化为Wieland–Gumlich aldehyde6分别需要一个羟化酶和一个还原酶来安装C18羟基并还原2,16双键图3a。我们初步考虑了五个细胞色素P450蛋白和四个中链脱氢酶/还原酶MDRs这些酶在与SnvGO共表达时r ≥ 0.95图2b因为这两类蛋白通常参与生物碱的合成。由于羟化和还原的顺序未知我们采用了番木鳖中的组合瞬时表达实验。通过在番木鳖叶片中同时表达所有候选细胞色素P450蛋白和MDRs并与SnvGO和SnvNS1一起进行处理确实导致了去甲氟箭毒素4的消耗和Wieland–Gumlich aldehyde6的生成图3a。在番木鳖叶片中同时浸泡一个细胞色素P450转录簇4032.6332CYP71A144与SnvGO、SnvNS1和缝籽嗪1后产生了一个羟基化产物——18-OH去甲氟箭毒素5并与合成标准物质共同洗脱图3b和扩展数据图2。在加入一个候选MDR转录簇4032.5004到共浸泡实验中后18-OH去甲氟箭毒素5被消耗Wieland–Gumlich aldehyde6开始积累图3b和扩展数据图3。因此我们将这个细胞色素P450命名为去甲氟箭毒素氧化酶SnvNO而将MDR命名为Wieland–Gumlich aldehyde合成酶SnvWS。值得注意的是植物体内和体外实验表明SnvWS能够还原去甲氟箭毒素4和18-OH去甲氟箭毒素5中的2,16双键图3a扩展数据图3和补充图9。SnvWS的立体选择性还原可能是通过4和5中亚胺部分的醇化引发的然后在β面上通过NADPH还原。随后的自发环化发生在C18羟基和C16醛之间可能由还原底物的构象灵活性促成形成6中的半缩醛补充图10。体外稳态动力学表明SnvWS在18-OH去甲氟箭毒素5上的催化效率高于去甲氟箭毒素418-OH去甲氟箭毒素5的kcat/Km 0.297 min−1 μM−1相比之下去甲氟箭毒素4为0.068 min−1 μM−1补充图11。SnvWS与18-OH去甲氟箭毒素5对接的模型表明SnvWS中的Thr95和Ser309可能与18-OH去甲氟箭毒素5中的C18羟基形成氢键从而解释了去甲氟箭毒素4和18-OH去甲氟箭毒素5之间催化效率的差异补充图10。没有任何细胞色素P450包括SnvNO可以羟基化去氧Wieland–Gumlich aldehyde7这表明反应的顺序是先氧化形成18-OH去甲氟箭毒素5然后进行还原反应。
为了完成从Wieland–Gumlich aldehyde6到士的宁10的生物合成必须安装一个新的哌啶酮环该环包含两个额外的碳原子图1中的环G。然而关于这一环构建的中间体或反应步骤尚不清楚唯一的线索是额外的两个碳单位C22和C23来自[14C]乙酸盐。为了促进发现这些隐秘的晚期生物合成步骤我们比较了士的宁生产植物和非生产植物。代谢分析表明非士的宁生产植物番木鳖种Strychnos sp.的主要生物碱是达波灵碱8补充图5该化合物很可能是由Wieland–Gumlich aldehyde6的N-乙酰化衍生而来图3a。因此我们假设番木鳖S. nux-vomica和番木鳖种Strychnos sp.应共享从缝籽嗪1到Wieland–Gumlich aldehyde6的相同生物合成途径图2c。果然通过对非生产者转录组进行BLAST搜索我们识别到了同源基因SpGOCYP71AY7氨基酸序列同一性为92%、SpNS1氨基酸序列同一性为92%、SpNS2氨基酸序列同一性为88%、SpNOCYP71A145氨基酸序列同一性为91%和SpWS氨基酸序列同一性为93%。为了验证这些基因的功能我们在番木鳖叶片中通过共浸泡缝籽嗪1表达了它们的两种组合SpGoSpNS1SpNO和SpWS以及SpGoSpNS2SpNO和SpWS。两种组合均导致了Wieland–Gumlich aldehyde6的生成图3b和扩展数据图4。达波灵碱8的唯一剩余生物合成步骤是吲哚胺的乙酰化图3a在生物碱的生物合成中这通常是由BAHD酰基转移酶催化使用乙酰辅酶A作为酰基供体。我们选择了四个BAHD酰基转移酶候选基因与所有五个基因共表达r 0.6图2d。通过瞬时表达其中一个候选酶SpAT与上游基因共同在番木鳖中表达生成了达波灵碱8图3b和扩展数据图4。
番木鳖S. nux-vomica中含有SpAT的同源基因转录簇4032.2753SnvAT氨基酸序列同一性为85%该基因在根部高度表达并且与之前识别的基因表现出高度的表达相关性与每个基因的r ≥ 0.99图2ab。然而番木鳖不产生达波灵碱8之前的喂养研究表明达波灵碱8并不是士的宁10的生物合成前体。因此我们推测SnvAT和SpAT可能具有不同的酶活性果然在番木鳖中同时表达SnvAT和SnvGO、SnvNS1、SnvNO、SnvWS以及缝籽嗪1后仅产生了微量的达波灵碱8。然而在叶片提取物中检测到了一个新的化合物其质量与一个马隆化产物相符提示SnvAT是一个主要具有马隆基转移酶活性的BAHD酰基转移酶图3b和扩展数据图5。尽管在番木鳖中表达该酶仅导致Wieland–Gumlich aldehyde6的部分消耗但我们假设转化可能受限于番木鳖叶片中马隆辅酶A的低浓度。因此我们与AAE13拟南芥的一种细胞质酶能产生可供细胞质SnvAT使用的马隆辅酶A一起表达了这些酶补充图12。将AAE13添加并共浸泡共底物二钠丙二酸到瞬时表达系统中导致马隆化产物的产生增加了十倍图3b和扩展数据图5。在纯化过程中这一产物迅速分解因此我们用三甲基硅基二氮杂甲烷处理了番木鳖叶片的粗甲醇提取物以甲基化羧酸然后用硼氢化钠还原醛基。通过与合成标准物质的比较确认了衍生化产物为N-马隆基Wieland–Gumlich aldehyde9图3a。因此尽管SnvAT和SpAT有85%的氨基酸序列相似性但它们具有不同的催化活性。系统发育分析表明SnvAT与SpAT在乙酰基转移酶分支中聚类而该分支与典型的马隆基转移酶分支在进化上有所不同补充图14。通过SnvAT和SpAT的同源建模补充图15我们识别出了一个氨基酸SnvATR424F和SpATF421R它控制乙酰基和马隆基转移酶活性之间的选择性补充图16和17。这些模型表明精氨酸残基通过与马隆辅酶A的羧基形成双配位盐桥负责马隆基辅酶A的选择性补充图18为这两种植物中生物碱积累的差异提供了直接的机制解释。值得注意的是在体外实验中17-O-酰化产物在生理pH条件下是主要产物补充图19这可能是由于非细胞环境中蛋白质活性的变化或Wieland–Gumlich aldehyde底物的开放和闭合形式的平衡差异。
值得注意的是在生成马隆化Wieland–Gumlich aldehyde9的番木鳖叶片的甲醇提取物中可以检测到微量的士的宁10和异士的宁11图3b和扩展数据图6。这两种生物碱积累并且9在室温存储时逐渐减少补充图22。事实上在浸泡底物4周后收获的番木鳖叶片中大部分9转化为士的宁10和异士的宁11图3b和扩展数据图6。将9与重组SnvAT或番木鳖粗蛋白提取物孵育并未加速9转化为10补充图23。这些实验表明9转化为士的宁10和异士的宁11可能在体外和生理条件下自发发生。或者将番木鳖叶片在60°C下加热2小时则显著加速了转化图3b和扩展数据图6。我们认为10和11是通过9中β-酮酸部分的脱羧反应形成α,β-不饱和酰胺随后C18羟基的oxa-迈克尔加成生成士的宁10。α,β-不饱和酰胺也可以通过互变异构形成β,γ-不饱和酰胺从而生成异士的宁11补充图24。
先前的放射性同位素标记研究表明通过加热来自番木鳖S. nux-vomica根部的酸性提取物可以将一个结构未表征的生物合成中间体转化为士的宁strychnine14,15。这个中间体被称为预士的宁prestrychnine参见补充图2中的之前提出的结构其化学性质与9相似。因此我们建议将预士的宁的结构修正为9。值得注意的是在这项喂养研究中放射性标记的预士的宁的水平在喂养番木鳖14C-色氨酸3天后比士的宁10高出9倍这表明预士的宁转化为士的宁10是一个缓慢的过程。事实上我们筛选了大量的α/β水解酶21,32和多酮合酶33以及已知能催化β-酮酸功能脱羧的这两类酶的成员还筛选了许多能够将预士的宁转运到液泡中的转运蛋白液泡内的酸性环境可能加速脱羧反应。然而这些基因候选并未加速士的宁10和异士的宁11的形成。为了确定预士的宁转化为士的宁是否是一个缓慢的、非酶促过程我们进行了氘标记Wieland–Gumlich aldehyde6的水培喂养实验。经过3天喂养后可以检测到标记的预士的宁9但士的宁10和异士的宁11在7天后才出现扩展数据图7。这些数据与之前的实验结果一致并且与我们在异源表达系统中观察到的士的宁形成速度一致。预士的宁9在番木鳖中缓慢转化为士的宁10的事实与非酶促过程一致尽管不能完全排除只有适度加速速率的酶的参与。
马钱子碱15是士的宁10的二甲氧基衍生物也在番木鳖的根部高度积累图3a和补充图4。为了鉴定羟化酶我们选择了12种与SnvGOPearson r 0.7有较高共表达相关性的完整细胞色素P450蛋白进行后续测试补充表1。当一个细胞色素P450转录簇4032.17050CYP82D367在士的宁10的存在下在烟草中表达时生成了10-OH士的宁12士的宁-10-羟化酶Snv10H图3c和扩展数据图8。番木鳖中的β-可鲁勃林13表明这两个甲氧基基团是依次安装的图3a因此我们接下来筛选了五种在番木鳖根部高度表达的甲基转移酶补充表2。在烟草中与Snv10H共同表达其中一种甲基转移酶转录簇4032.16453SnvOMT时生成了与合成β-可鲁勃林13相对应的化合物图3c和扩展数据图8。上述12种共表达的细胞色素P450蛋白中没有催化β-可鲁勃林13的羟基化反应但在根部高度积累的最终产物马钱子碱15促使我们识别了另外13种在根部强烈表达FPKM≥20的细胞色素P450蛋白补充表1。在这13种蛋白中我们最初针对了3种属于CYP71支系的蛋白补充图25。其中一个细胞色素P450蛋白转录簇4032.16581CYP71AH44Snv11H与士的宁、Snv10H和SnvOMT共同表达时生成了马钱子碱15作为主要产物同时还生成了少量羟基化产物11-deMe马钱子碱14图3c和扩展数据图9。当我们仅用Snv11H浸泡合成的β-可鲁勃林13时仅生成11-deMe马钱子碱14只有在有SnvOMT的情况下才生成马钱子碱15扩展数据图9。体外和植物体内实验表明SnvOMT也可以将11-OH士的宁16甲基化生成α-可鲁勃林17补充图26并将10-deMe马钱子碱18甲基化生成马钱子碱15补充图27尽管效率较低。总体而言这些结果突出显示了使用合成生物学方法生产番木鳖型生物碱的潜力尽管需要对异源宿主生产系统进行大量优化。
完成马钱子碱15的生物合成途径后我们接着在烟草中重建了从缝籽嗪1到马钱子碱15的途径。我们在烟草叶片中瞬时表达了所有酶SnvGO、SnvNS1、SnvNO、SnvWS、SnvAT、AAE13、Snv10H、SnvOMT和Snv11H并浸泡了缝籽嗪1和二钠丙二酸。如果在浸泡底物后1周收获烟草叶片就观察到士的宁10、异士的宁11、β-可鲁勃林13和马钱子碱15的积累图3d和补充图28。此外除了11-deMe马钱子碱14外该途径中的所有中间体都可以在番木鳖根部检测到图3a和扩展数据图10这表明在烟草中异源重建的途径与番木鳖植物中的生理相关途径相匹配。
在此我们报告了通过化学逻辑、-组学数据集和酶学表征相结合的方式发现了九种酶这些酶能够将缝籽嗪1转化为达波灵碱8、士的宁10和马钱子碱15。士的宁结构和合成的开创性研究为发现士的宁生物合成中的酶奠定了基础。这些发现不仅揭示了植物如何合成这些多样的生物碱而且为异源生产番木鳖生物碱衍生物提供了遗传基础从而通过代谢工程方法发现有效的先导化合物为合成生物学带来了新的挑战。
