南开做网站的公司,天津招标信息网官网,北京服装设计公司,网络推广seo公司引言 本系列[1])将开展全新的转录组分析专栏#xff0c;主要针对使用DESeq2时可能出现的问题和方法进行展开。 为何使用未经标准化的计数数据#xff1f; DESeq2 工具包在接收输入时#xff0c;期望得到的是未经处理的原始计数数据#xff0c;比如从 RNA-seq 或其他高通量测… 引言 本系列[1])将开展全新的转录组分析专栏主要针对使用DESeq2时可能出现的问题和方法进行展开。 为何使用未经标准化的计数数据 DESeq2 工具包在接收输入时期望得到的是未经处理的原始计数数据比如从 RNA-seq 或其他高通量测序实验中获得的这些数据以整数值矩阵的形式呈现。在这个矩阵中第 i 行第 j 列的数值表示在样本 j 中可以归属于基因 i 的读段数。同样地对于其他类型的实验矩阵的行可能代表结合区域例如 ChIP-Seq 实验或肽序列例如定量质谱实验。 矩阵中的数值应当是未经标准化的读段计数对于单端 RNA-seq或片段计数对于双端 RNA-seq。RNA-seq 的工作流程中描述了多种制备此类计数矩阵的技术。为 DESeq2 的统计模型提供计数矩阵作为输入非常关键因为只有原始的计数数据才能准确评估测量的精确度。DESeq2 模型在内部会校正文库大小的影响因此不应该使用经过转换或标准化的数值比如按文库大小调整后的计数作为输入数据。 DESeqDataSet 对象 在 DESeq2 工具包中用于存储读取计数和统计分析过程中的中间估计量的类对象是 DESeqDataSet通常在代码中以 dds 表示。 技术细节上DESeqDataSet 类扩展了 SummarizedExperiment 包中的 RangedSummarizedExperiment 类。“Ranged” 指的是测定数据的行即计数可以与基因组的特定区域如基因的外显子相关联。 DESeqDataSet 对象必须关联一个设计公式。这个公式描述了将在模型中使用的变量通常以波浪号 (~) 开始后跟用加号 () 分隔的变量如果不是公式形式系统会自动转换。设计公式可以在后续更改但需要重新执行所有差异分析步骤因为设计公式用于估计离散度和模型的 log2 倍数变化。 注意为了利用包的默认设置应将感兴趣的变量放在公式的末尾并确保对照组水平是第一水平。 接下来将展示根据在 DESeq2 之前使用的管道不同构建 DESeqDataSet 的四种方法 从转录丰度文件和 tximport 生成 从计数矩阵生成 从 htseq-count 文件生成 从 SummarizedExperiment 对象生成 转录本丰度数据 建议在使用 DESeq2 之前先采用快速的转录本丰度定量工具然后通过 tximport导入这些定量数据来创建 DESeq2 所需的基因水平计数矩阵。这种方法允许用户从多种外部软件中导入转录本丰度估计值包括以下方法Salmon; Sailfish; kallisto ;RSEM 采用上述方法进行转录本丰度估计的好处包括i这种方法能够校正样本间可能的基因长度变化例如由于异构体的不同使用ii其中一些方法Salmon, Sailfish, kallisto相比需要创建和存储 BAM 文件的基于比对的方法速度显著更快且对内存和磁盘空间的需求更少以及iii可以避免丢弃那些能够与多个具有同源序列的基因对齐的片段从而提高检测的灵敏度。 请注意tximport-to-DESeq2 方法使用的是转录本丰度定量器估计的基因计数而不是标准化计数。 在这里将展示如何从存储在 tximportData 包中的 Salmon quant.sf 文件导入转录本丰度并构建一个基因水平的 DESeqDataSet 对象。 library(tximport)library(readr)library(tximportData)dir - system.file(extdata, packagetximportData)samples - read.table(file.path(dir,samples.txt), headerTRUE)samples$condition - factor(rep(c(A,B),each3))rownames(samples) - samples$runsamples[,c(pop,center,run,condition)]## pop center run condition## ERR188297 TSI UNIGE ERR188297 A## ERR188088 TSI UNIGE ERR188088 A## ERR188329 TSI UNIGE ERR188329 A## ERR188288 TSI UNIGE ERR188288 B## ERR188021 TSI UNIGE ERR188021 B## ERR188356 TSI UNIGE ERR188356 B 接下来使用适当的样本列指定文件的路径并读取一个将转录本与该数据集的基因链接起来的表。 files - file.path(dir,salmon, samples$run, quant.sf.gz)names(files) - samples$runtx2gene - read_csv(file.path(dir, tx2gene.gencode.v27.csv)) 使用 tximport 函数导入 DESeq2 所需的量化数据。 txi - tximport(files, typesalmon, tx2genetx2gene) 最后可以根据样本中的 txi 对象和样本信息构造一个 DESeqDataSet。 library(DESeq2)ddsTxi - DESeqDataSetFromTximport(txi, colData samples, design ~ condition) 这里的ddsTxi对象就可以在下面的分析步骤中用作dds。 Reference [1] Source: https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html 本文由 mdnice 多平台发布
