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生物防治是利用细菌接种剂来改变植物根际微生物群落的组成#xff0c;但在以往研究中存在有接种的细菌在根际建立不良#xff0c;与本地微生物组争夺资源#xff0c;干扰本地微生物的…大家好这里是专注表观组学十余年领跑多组学科研服务的易基因。
生物防治是利用细菌接种剂来改变植物根际微生物群落的组成但在以往研究中存在有接种的细菌在根际建立不良与本地微生物组争夺资源干扰本地微生物的问题。而与细菌接种剂相比噬菌体的主要好处是它们的宿主特异性和只要有宿主细菌存在即便是在其他微生物群落存在的情况下还能快速繁殖的能力。噬菌体可以作为精确的工具来瞄准病原体而不影响周围的微生物群落。
噬菌体可以通过生态和进化机制控制病原体。病原菌密度的调控是主要的生态机制。主要的进化机制是噬菌体抗性和其他重要的病原体生活史特征之间的适应性权衡。对于植物致病性番茄枯萎病(Ralstonia solanacearum)细菌是细菌性枯萎病的病原体能够感染全球多种重要的作物。
2019年12月南京农业大学/江苏省有机固体废物利用重点实验室Ville-Petri Friman、韦中博、沈其荣为共同通讯作者在《Nature Biotechnology》杂志上发表题为“Phage combination therapies for bacterial wilt disease in tomato”的研究论文该研究分析了在番茄植物根际上的噬菌体治疗对致病性细菌茄青枯病的影响揭示了特定噬菌体组合有可能成为控制植物病原菌的精确工具。 标题Phage combination therapies for bacterial wilt disease in tomato噬菌体联合治疗番茄细菌性青枯病
时间2019-12-02
期刊Nature Biotechnology
影响因子46.9 / 1区 研究摘要
噬菌体已被提议作为杀虫剂的替代品来杀死作物的细菌病原体。然而噬菌体生物防治的功效可变在天然根际微生物群落中了解甚少。本研究将不同噬菌体组合对番茄青枯菌感染的生物防治效果进行分析分析结果表明在单一作物季节的温室和大田试验中增加组合中噬菌体数量可将疾病发病率降低80%。疾病发生率降低是由于病原体密度降低和对噬菌体抗性但生长缓慢的病原体菌株选择以及对青枯菌拮抗的细菌种类富集噬菌体处理不会影响现有根际微生物群落。本研究揭示了特定噬菌体组合有可能成为控制植物病原菌的精确工具。 研究方法
文章采用番茄“河作903”品种细菌茄青霉也就是青枯假单胞菌选取菌株为QL-Rs1115。选取的四种噬菌体都是有尾噬菌体目中的短尾噬菌体科的噬菌体。 文章技术路线为 研究结果
1噬菌体对温室和田间病害产生的影响
本次实验使用的噬菌体组合由一到四种噬菌体类型组成这些噬菌体从中国番茄田里分离出来具有高度的遗传相似性。 图1噬菌体对温室和田间病害产生的影响
图ab 是温室试验图c是大田试验的结果。红色虚线表示在没有噬菌体的对照处理中观察到的值
图a随噬菌体数目的增加青枯病的发病率有所下降
图b在b图上能发现噬菌体组合内噬菌体数量的增加使得病原体的密度降低但增加噬菌体数量对噬菌体本身的密度也有负面影响。这也说明了噬菌体密度与宿主丰度有关。
图c大田试验里单个噬菌体和四噬菌体组合与control组对植株病害指数的影响出现显著差异control组小提琴图上的散点比较集中分布40-80%这个病害指数范围单个噬菌体和四噬菌体组合散点均集中下部分与对照处理相比四噬菌体组合青枯病疾病指数平均降低80%。
所有噬菌体类型都能有效地减少青枯病的发病率而在两种环境条件下温室和田间均能发现组合施用对青枯病的防治效果更好。 2温室试验中噬菌体耐药性的演变。对祖先和共同进化的噬菌体的抗性进化。 图2温室试验中噬菌体耐药性的演变。对祖先和共同进化的噬菌体的抗性进化。
图abc噬菌体对祖先噬菌体(a,b)和共同进化的噬菌体(b)的平均抗性(c)在没有噬菌体的情况下在生长24小时后的病原体携带能力。
图a箱线图显示了四分位数范围上4分位数下4分位数中位数为线异常值为点。上方小写字母表示处理间差异显著。所有噬菌体类型,不管是单个还是组合噬菌体都选择了对祖先噬菌体具有增强抗性的病原体这可以从图a各类噬菌体都高于红线可以看出这里的红线表示在没有噬菌体的情况下病原体进化的对照病原体选择线的抗性
图b线性在暴露于噬菌体组合时病原体进化出最广的噬菌体抗性范围我们可以看到共同进化的噬菌体的平均抗性显著高于祖先噬菌体。
图c随噬菌体数目增加病原体的携带能力降低这个携带能力代表病原体生长情况也就是说随噬菌体组合数目增加病原体的生长情况下降红线表示无噬菌体条件下祖先病原体的生长情况(c)。
图d病原菌携带能力与噬菌体耐药性呈负相关随噬菌体组合中数量的增加对于祖先噬菌体的平均抗性明显增加可以看到不同颜色扎堆集中的位置随着抗性的增强病原体携带能力显著下降。黑线是平均回归右上角表示不同噬菌体组合处理下病原菌携带能力与噬菌体耐药性之间回归系数的增加。噬菌体组合可以选择与降低发病率相关的耐药但生长缓慢的病原体。 3噬菌体对根际微生物群落落的影响。 图3噬菌体对根际微生物群落落的影响。
图a群落组成基于NMDS分析点与点也就是样本之间的距离表示差异程度在坐标图上距离越近的样本相似性越高可以看得到N1和N3之间的差异最大。
图b多样性基于OTUs的Shannon多样性分析红色虚线表示无噬菌体对照处理随噬菌体组合中噬菌体数量的增加与细菌群落多样性随之增加。
图c随噬菌体组合数目变化不同噬菌体组合处理下病原体(黑色)和其他细菌门(其他颜色)的相对密度发生变化箭头表示每个门和病原体的显著性变化及其方向(向上和向下分别表示丰度的增加和减少)。根据附录补充叶绿素门、植物门和厚壁菌门相对丰度较高变形菌门和拟杆菌门相对丰度较低。
图d基于OTUs构建了单噬菌体和三噬菌体群落的共发生网络并使用Netshift分析来确定群落变化背后潜在的重要驱动类群。图上的点的大小与其缩放的NESH值成正比(这个值用来确定关联网络中给定微生物类群的重要性)如果这个细菌在两个组合比较中重要性增加这个点就会标记成红色。外围橙色类群是随着噬菌体数目增加而丰富蓝色是随着数量增加而减少灰色这些细菌不受数目的影响。里面的线跟外围的标记没有关系蓝线代表的是在单个噬菌体群落里自己独有的关联红色线是在三噬菌体群落里独有的关联黑色线是两种噬菌体群落共有的关联。单噬菌体72个独有的关联三噬菌体处理230个独特的关联两个处理中共有的只有9个。大多数类群关联在单个噬菌体和三个噬菌体群落之间是完全不同的并且显著关联的数量随着噬菌体数量的增加而增加(分别为72和230个关联)。附录信息内可以看出单菌体网络连接更紧密路径长度更短表明相互作用可能更频繁。在这些分类群中与单噬菌体群落相比噬菌体群落中有16个丰度增加7个丰度减少其中红色箭头指向的5个菌它们在改变网络结构中起着重要作用。 4噬菌体特异性及其对根际微生物群落抑制的影响。
为了验证上述的变化不是由噬菌体直接驱动的作者做了个短期实验来测试病原体和噬菌体组合如何影响根际群落的组成和多样性使用从温室试验中使用的相同土壤制备的土壤洗土。 图4噬菌体特异性及其对根际微生物群落抑制的影响。
图a群落组成PCA分析pca1轴pca2轴%代表这个轴对整体的解释度主要看分组之间的距离看分组之间有没有比较开样本之间比较远解释度越高降维代表性越好。右边图注天然细菌群落加噬菌体加病原体两者组合存在的天然细菌群落。
图b箱形图显示了25%到75%的数据的四分位数范围中位数为线异常值为点上方小写字母表示处理间差异显著(多重比较采用Tukey检验经FDR校正P 0.05)。
图a,b发现在没有病原体的情况下噬菌体的存在并不影响微生物群落的组成或多样性而病原体单独存在的影响较大。噬菌体的存在限制甚至阻止了病原体介导的群落组成和多样性的变化。为了更详细地探讨这一点作者从同一根际土壤中随机分离了400株可培养的细菌菌株并分别测试了它们对感染番茄红霉的噬菌体的敏感性(图c)。
图c基于400个可培养菌株的系统发育树在进化图中不同的节点颜色表示四个不同的门:变形菌门(44.00%;红色)厚壁菌门(23.25%;蓝色)拟杆菌门(20.25%;紫色)和放线菌(12.50%;绿色);里圈不同颜色的环是在不同的分类水平上观察到的细菌OTUs从里到外分类水平就是门纲目科属种。发现四种噬菌体都不能感染400株菌株中的任何一株(补充图11)。这些结果都表明噬菌体只能够感染病原体而根际微生物群落组成、多样性和物种共生网络的变化是由间接反馈驱动的。
接着探索了在属水平上噬菌体存在下增加的细菌分类群的功能特性。细菌属丰度与群落中存在的噬菌体数量呈显著正相关(22.30%正相关6.68%负相关附录Fig. 12a)受显著影响的属多属于变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和绿藻门Fig. 12b)。为了确定富集的细菌分类群如何与病原体相互作用在实验室中使用祖先病原体和所有400个分离的非致病性根际细菌进行了两两竞争共培养实验(c)。
图d蓝色灰色和橙色虚线分别表示随着噬菌体组合中噬菌体数量的增加细菌分离物对祖先病原体的平均抑制作用降低不显著相关或丰度增加。5个属的菌株(OTUs)对古葡萄球菌病原体的抑制作用菌株的噬菌体数量不断增加。发现不动杆菌属(n 12)、芽孢杆菌属(n 67)、单胞菌属(n 7)、芽孢杆菌属(n 10)和红球菌属(n 4)的富菌对病原体大多具有拮抗作用导致病原菌生长平均减少64.89%(图4d)。因此这些细菌可能在温室试验期间通过资源竞争或干扰竞争来抑制番茄红霉。 5噬菌体生物防治的生态学和进化特征。 图5探索噬菌体介导对青枯病的作用机制。
上图是一个结构方程模型路径图用来揭示噬菌体介导的疾病发生率背后的生态和进化机制。红色、蓝色和灰色箭头分别表示积极、消极和不显著的路径箭头旁边的数字表示这些影响的大小。圆圈内的数字表示由其他变量解释的方差百分比χ2和NFI值表示模型的拟合。
利用偏最小二乘结构方程模型分析(PLSSEM)和路径建模估计来揭示温室中噬菌体生物防治成功背后的生态和进化机制的相对重要性。
探讨了噬菌体组合的有益作用是如何通过病原体密度降低和噬菌体耐药性-生长权衡的进化来介导的。最终的完整模型具有合理的拟合可以解释36%的发病率变化(χ2 31.7规范拟合指数(NFI) 0.81)并且组合中噬菌体数量的增加增加了噬菌体抗性水平降低了病原体生长(携带能力)。病原体携带能力的降低与病原体丰度的降低正相关而病原体丰度的降低反过来又与疾病发病率呈正相关。这表明噬菌体介导的对高抗性但生长缓慢的病原体的选择对病原体丰度的降低和相关的疾病发病率的降低有很大贡献。
此外病原体丰度与微生物群落多样性呈负相关而噬菌体耐药性进化与高微生物群落多样性呈正相关。通过构建不那么复杂的s.e.m进一步验证了这些结果(补充图13)噬菌体数量的增加通过承载能力对病原菌密度产生负向影响(λ 0.514)微生物群落多样性(Shannon指数)与病原菌密度呈负相关(λ - 0.467)病原菌密度的变化对疾病发病率的影响比微生物群落多样性的变化更重要(λ 0.460)。这些结果都表明生态和进化机制在解释疾病发病率降低方面都很重要。 研究小结
噬菌体生物防治的效果是由生态机制(噬菌体杀死病原体)和进化机制介导的因为疾病的减少与对高度耐药但生长缓慢的病原体的选择有关。噬菌体对病原体的作用间接改变了病原菌常驻菌群的组成和多样性丰富了对病原菌具有高度拮抗作用的细菌类群。结果强调了在设计用于农业和生物技术的噬菌体疗法时考虑微生物群落背景下的生态和进化机制的重要性。增加噬菌体数量提高了噬菌体组合的生物防治效果包括在温室和田间试验中更大幅度地降低病原体密度、疾病发病率和疾病指数。当病原体同时暴露于多个噬菌体时它们能够进化出对祖先噬菌体和共同进化的噬菌体的抗性。这一结果表明噬菌体多样性可能会影响共同进化动力学的类型以及对通才或专才噬菌体抗性策略的选择。一种潜在的机制可能是不同噬菌体的选择可能会损害几种噬菌体受体导致耐药性成本上升。同时发现一些细菌类群其丰度与噬菌体组合中存在的噬菌体数量正相关通过资源竞争或干扰竞争对病原体表现出高度拮抗作用。也确定几个候选驱动分类群这些分类群在细菌共发生网络中发挥关键作用并且与单噬菌体细菌群落相比它们在三噬菌体中丰富。
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Wang X, Wei Z, Yang K, Wang J, Jousset A, Xu Y, Shen Q, Friman VP. Phage combination therapies for bacterial wilt disease in tomato. Nat Biotechnol. 2019 Dec;37(12):1513-1520. pii: 10.1038/s41587-019-0328-3. doi: 10.1038/s41587-019-0328-3. PubMed PMID: 31792408. 相关阅读
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