网站建设进展情况汇报,创建网站并制作首页教案,wordpress 鼠标点击,排版今天给同学们分享一篇单细胞实验的生信文章“Identification of RAC1 in promoting brain metastasis of lung adenocarcinoma using single-cell transcriptome sequencing”#xff0c;这篇文章于2023年5月18日发表在Cell Death Dis期刊上#xff0c;影响因子为9。 本研究旨…今天给同学们分享一篇单细胞实验的生信文章“Identification of RAC1 in promoting brain metastasis of lung adenocarcinoma using single-cell transcriptome sequencing”这篇文章于2023年5月18日发表在Cell Death Dis期刊上影响因子为9。 本研究旨在为肺腺癌LUAD脑转移的生物标志物、相关途径和潜在疗法提供一个新的视角。作者利用 scRNA-seq 方法对一名 LUAD 患者的循环肿瘤细胞CTCs、原发肿瘤组织和转移肿瘤组织进行了全面的单细胞水平转录组分析以确定与转移相关的生物标记物。 1.nbsp;单个患者样本数据分析显示RAC1 在转移细胞中高度富集
作者首先对一名 LUAD 患者患者 1的 168 个单细胞进行测序包括原发组织、CTC 和转移组织。根据管道中的标准进行过滤和修剪后168 个样本中有 124 个通过了质量控制。 图1 研究设计概述 有趣的是PC1/2 中的 CTCs 更接近转移瘤而 PC1/3 中的 CTCs 更接近原发肿瘤。在 PC2/3 中CTCs 也显示在转移组和原发组之间这意味着癌症在转移过程中处于过渡或中间状态。尽管细胞之间存在异质性但大多数样本都按其原发组织进行了分组这可能是由于样本量较小的缘故。然后作者根据差异表达基因分析了组织特异性标记物并绘制了热图图 1。 图2 1 名 LUAD 患者的单细胞分析 作者推测CTC 在原发期到转移期的过渡阶段起着过渡作用在发病过程中促进转移的通路可能会增强。作者分析了明显增强的转移至 CTC 和 CTC 至原发的 DEGs发现了一组持续上调的基因表 S1。LCN2、SAT1、RAC1、IFITM3、VAMP8、RAB13、NFKBIA 和 S100A4 等基因在 CTC 中升高在 MTT 细胞中甚至更高。Violin 图显示了 原发肿瘤组织PTT-CTC-MTT 中逐渐上调基因的表达谱图 2c)。功能注释表明这些转移相关基因组在调控细胞死亡和凋亡以及促进大分子组织方面发挥了关键作用图 2d。根据以往的文献RAC1 对细胞运动具有不可分割的重要作用有助于细胞的爬行、侵袭、增殖、抗凋亡等。 为了揭示EMT状态作者使用EMT特征来量化每个癌症单细胞的上皮细胞和间质细胞得分。EMT特征热图显示了三种癌症群体的独特模式。MTT 中上皮信号比例较高而 PTT 则显示出间质状态的倾向。CTCs的E或M得分较低这可能是由于它们在血液中处于过渡状态。作者进一步扩大了数据集使用所有 8 名患者的 452 个细胞272 个来自转移癌细胞180 个来自原发癌细胞研究了上皮标记、间充质标记和 EMT 相关通路标志。结果显示原发性癌细胞中间质标志物较多如 NCAM1、LAMB1、SERPINE1、TCF4、VIM、ZEB1 和 ZEB2而转移性癌细胞中上皮标志物较多如 CDH1、CLDN4、ELF3、EPCAM、KRT18、KRT7 和 KRT8。有趣的是一些 EMT 通路信号分子在转移细胞中上调包括 AKT1、MAPK1、MAPK3、RAS 基因NRAS、KRAS 和 HRAS、ROS1 和 PTK2。 2.nbsp;联合分析多个患者样本探索 RAC1 相关基因和通路
为了验证转移相关分子作者招募了另外7名患者通过使用原发组织或转移组织进行单细胞测序。来自8名患者的单细胞的T-SNE图显示细胞聚集成12个稳定的亚群其中RAC1在转移性癌症细胞中高度表达图3a。绘制热图每个亚组都显示出其独特的特征基因图3b。与原发性肿瘤和正常肺上皮簇相比在转移亚组和CTC中发现RAC1和RAC1相关基因包括RHOA、CDC42和VEGFB的高表达图3c。共表达网络显示计算了与RAC1密切相关的基因其中癌症基因如MUC1、MUC20、CEACAM5和CCL20与RAC1的表达呈正相关而TIMP3和MGP与RAC1表达呈负相关图3d。火山图显示了RAC1高表达细胞和RAC1低表达细胞之间肿瘤细胞中不同表达的基因图3e。功能聚类和通路分析表明RAC1高表达细胞中的基因在粘附、ECM和VEGF信号通路中发挥着关键作用图3f。 图3 8例LUAD患者的单细胞分析 为了证明LUAD的演变作者绘制了一张基于Monocle 2的图表。实心黑线代表了构建的最小生成树的主要路径它展示了LUAD沿着伪时间连续体发展的主干和顺序。轨迹清楚地表明该树从8_Pulmonary_Epithelis开始经过亚组6、11、3、2、7并以5_LUAD_M_S100A8结束。基于伪时间连续谱作者基于调节的内核进化富集基因功能注释确定了具有代表性的GOBP和KEGG集中项。 3.nbsp;RAC1 是肿瘤转移的标志物预后不良
作者还从公开的 RNA 和蛋白质数据集以及 LUAD 患者的 IHC 染色中获得了 RAC1 的病理证据。作者首先分析了 HPA 数据集中的 LUAD 患者图像。与正常组织相比LUAD组织中RAC1的综合光学密度IOD水平明显升高正常组织n 3LUADn 3折叠变化 2.63P 0.01图4a、b。来自 6 名原发性和转移性 LUAD 患者的其他组织样本被用于 RAC1 染色分析。IOD 结果显示 RAC1 在转移瘤中的高表达正常组织n 6LUADn 6折叠变化 3.83P 0.05图 4cd。通过使用 TCGA 数据集Oncolnc 在线工具作者分析了基于 RAC1 表达的 LUAD 患者生存情况。RAC1高表达的LUAD患者生存时间较短红线中位生存期为1081天相比之下RAC1低表达的患者生存期更长为1798天P 0.0015图4a)。 图4 LUAD 患者的病理证据 4.nbsp;从多个角度看 RAC1 的表达水平会加速肺癌细胞的生长和转移
使用AnnexinV-PI和流式细胞术分析细胞凋亡图5b、c显示RAC1抑制剂可显著促进两种LUAD细胞系的细胞凋亡H1975的P 0.001A549的P 0.001。RAC1激动剂降低了细胞系中凋亡细胞的比例H1975P 0.01A549P 0.01。在细胞周期方面RAC1抑制剂阻碍了细胞从G0/G1期向S期的转变G0/G1期增强P 0.001S期抑制P 0.001从而阻止了细胞分裂图5d、e。qPCR 和 WB 结果还显示RAC1 抑制剂可降低细胞周期相关基因和蛋白CDK4、CDK6、CyclinD1的表达而 RAC1 激动剂可促进细胞周期相关基因的表达图 5f、g。经 Transwell 试验验证激活的 RAC1 功能可显著提高两种细胞系的侵袭能力H1975P 0.01A549P 0.05图 6a、b而 RAC1 功能被破坏的细胞则表现为无活性H1975P 0.05A549P 0.05。划痕伤口愈合试验表明活化的 RAC1 能增强肺癌细胞在平板上的迁移能力H1975P 0.01A549P 0.05。然而在 RAC1 抑制剂存在的情况下A549P 0.01和 H1975P 0.001的伤口愈合速度更慢图 6cd。类胶体素染色结果表明RAC1 抑制剂能显著抑制肺癌细胞中聚合肌动蛋白的表达P 0.01而 RAC1 激动剂能显著促进肺癌细胞中聚合肌动蛋白的表达P 0.05图 6c。 图5 RAC1 可促进肿瘤细胞的增殖和细胞周期 图6 RAC1 促进了 LUAD 细胞的侵袭性和迁移能力 与空白组无肿瘤负荷相比NC组和RAC1-OE组的MRI结果均显示有肿瘤负荷RAC1-OE的原发灶性肿瘤在重量上明显重于NC组P 0.001图7ab。qPCR结果显示RAC1过表达H1975细胞被成功构建图7c。作者仔细研究了RAC1-OE小鼠的不同断层图像发现转移位点仅发生在大脑中在其他器官尤其是肝脏、骨骼或肾上腺中未观察到转移。脑HE切片中有几个转移位点其中最大的转移位点在右顶叶和侧脑室这与MRI成像结果一致图7d。RAC1-OE组中RAC1、CDK4、CDK6和CyclinD1的表达显著增加图7e。 图7 动物实验 总结
在本研究中作者在单细胞水平上获得了对癌症肺转移的更全面的了解为RAC1在LUAD脑转移中的作用以及参与转移过程的相关途径提供了新的视角。这项研究为进一步揭示LUAD转移的作用机制提供了坚实的证据。
